ადამიანის მოლეკულური გენეტიკის კვლევის მეთოდები და კვლევის ძირითადი იარაღები

დნმ-ის და რნმ-ის ანალიზი საჭიროებს უჯრედული ან ქსოვილური ნიმუშებიდან ერთი გაკვეული დნმ-ის ან რნმ-ის თანამიმდევრობის დეტექციას, მრავალ სხვა თანამიმდევრობათა შორის. ზოგჯერ მილიონობით ფრაგმენტის შემცველ ნარევში სპეციფიკურ დნმ-ის ფრაგმენტის მოძიება ხდება საჭირო. 

ერთ-ერთი მეთოდი, რომელსაც ამ შემთხვევაში მიმართავენ, არის საუზერნ ბლოტინგი (Southern bloting)

საუზერნ ბლოტინგი (Southern bloting)

ეს ტექნოლოგია გასული საუკუნის 70-იან წლებში შეიმუშავეს და იყენებენ როგორც სტანდარტულ მეთოდს, რესტრიქციული ფრაგმენტებით დანაწევრებული დნმ-ის ფრაგმენტების საანალიზოდ. ადამიანის დნმ-ის წყაროდ სხეულის ნებისმიერი უჯრედი გამოდგება სისხლის წითელი უბირთვო უჯრედების გარდა. ნებისმიერი ქსოვილის თუ ორგანოს ბიოფსიური მასალიდან აგაროზის გელში ელექტროფორეზით ახდენენ 1 მლმდე დნმ-ის ფრაგმენტის სორტირებას ზომის მიხედვით. შემდეგ ფრაგმენტებს ფლუორესცენტული საღებავით ღებავენ. გენომური დნმ-ის ფრაგმენტები მნათი ლაქების სახით გამოჩნდება. დნმ-ის სპირალური დენატურაციის შემდგომ დნმ-ის ერთძაფიან მოლეკულას გადაიტანენ გელიდან ფილტრებზე.

ფილტრზე არსებული მილიონამდე ფრაგმენტიდან ერთი-ორი სასურველი ფრაგმენტის იდენტიფიკაციისათვის იყენებენ სპეციფიკურ (მონიშნულ) ზონდებს. აწარმოებენ მონიშნული ზონდის და ფილტრის ერთობლივ ინკუბაციას ხსნარში ისეთი რეჟიმით, რომელიც ხელს უწყობს ორძაფიანი დნმ-ის მოლეკულის ფორმირებას. თუ ზონდი თავადაა კლონირებული, მაშინ, დნმ-ის მოლეკულის ნაწილი, ჩვეულებრივ, ჰიბრიდირებს ფილტრზე არსებულ ერთ ან ორ ფრაგმენტთან, ხოლო თუკი ზონდი არის კლონირებული კომპლიმენტარული დნმ, მაშინ შესაძლოა მოხდეს მრავალი ფრაგმენტის ჰიბრიდიზაცია, რაც განპირობებულია ინტრონების არსებობით. დაუკავშირებელი ზონდის ჩამორეცხვის შემდეგ ახდენენ ფილტრის ექსპოზიციას რენტგენის ფირზე, ზონდთან ჰიბრიდირებული ერთი-ორი ფრაგმენტის ადგილმდებარეობის გამოსავლენად.

საუზერნ ბლოტინგი მსოფლიოს მრავალი მოლეკულური დიაგნოსტიკის ლაბორატორიებში კვლავ რჩება გენეტიკური დაავადებების დიაგნოსტიკის სტანდარტულ მეთოდად, თუმცა ბევრგან მას უკვე ჩაენაცვლა PCR-ზე დაფუძნებული მეთოდები.

ნოზერნ ბლოტინგი (Nothern bloting)

წარმოადგენს საუზერნ ბლოტინგის ანალოგიურ მეთოდს რნმ-ის ნიმუშების ანალიზისათვის. ამ მეთოდით განსაზღვრავენ გარკვეული გენიდან გადაწერილი მ-რნმის ზომას და რაოდენობას რნმ-ის ნიმუშში.

პოლიმერიზაციის ჯაჭვური რეაქცია (PCR)

პოლიმერიზაციის ჯაჭვური რეაქცია  PCR კლონირების ალტერნატიული მეთოდია, რომელიც საშუალებას იძლევა დამმზადდეს დნმ-ის ან რნმ-ის თანამიმდევრობათა ასლების შეუზღუდავი რაოდენობა.  PCR-ს შეუძლია დნმ-ის ან რნმ-ის ერთი მოლეკულიდან რამდენიმე საათში მოგვცეს მილიარდი ასლი. ამ მართლაც რევოლოციურმა აღმოჩენამ უდიდესი მნიშვნელობა შეიძინა გენეტიკური დაავადებების მოლეკულური დიაგნოსტიკის და მოლეკულური ანალიზის საქმეში. 

PCR-ის არსი ისაა, რომ ამ მეთოდით ხდება ორ ოლიგონუკლეოტიდურ “პრაიმერს” შორის მოქცეული დნმ ის ფრაგმენტის ფერმენტული ამპლიფიკაცია - გენთა რიცხვის გაზრდა (ასობით, მილიონობით). ამფლიფიკაციის პროცესი სპეციალური  PCR-ხელსაწყოს გამოყენებით სულ რამდენიმე წუთს გრძელდება. რამდენიმე საათის შემდეგ კი შესაძლებელია საწყისი ნუკლეოტიდური თანამიმდევრობების უკვე მრავალმილიარდიანი ასლების პროდუცირება.

                            PCR - 3 ეტაპი                        

ის, რაც წინათ ძალიან შრომატევადი პროცედურა იყო, ახლა ერთ დღეში მთავრდება. PCR-მა დიდად შეუწყო ხელი დნმ-ის მრავალი სადიაგნოსტიკო ტესტის დახვეწას და კლინიკაში დანერგვას.

PCR უაღრესად მგრძნობიარე მეთოდია, მისი საშუალებით შესაძლებელია ავადმყოფისაგან აღებულ სისხლში კლონირებისა და საუზერნ, ან ნოზერნ ბლოტინგის გარეშე მოხდეს გარკვეული გენის თანამიმდევრობის დეტექცია და ანალიზი. ანალიზი შეიძლება ჩატარდეს ერთ უჯრედზეც კი, რომელიც შესაძლოა გამოიყოს თმის ძირიდან, ბოკალური უჯრედებიდან, რომელსაც შეიცავს პირში ნავლები წყალი, გამშრალი სისხლის წვეთი, რომელიც დარჩა დანაშაულის ადგილზე და რაც მთავარია,  PCR გამორიცხავს ქსოვილის სინჯებიდან დიდი რაოდენობით დნმ-ის და რნმ-ის მოპოვების აუცილებლობას. ამიტომაც, ის სწრაფად იქცა დნმ-ის და რნმ-ის სინჯების საანალიზო სტანდარტულ მეთოდად, სხვადასხვა სახის კვლევით ლაბორატორიებში.

ქრომოსომების IN SITU ჰიბრიდიზაცია

ამ მეთოდს in situ ჰიბრიდიზაციის მეთოდს უწოდებენ, რადგან მეტაფაზურ ქრომოსომაში დაფიქსირებულ დნმ-ის დენატურციას ახდენენ ადგილზე (in situ), რათა მოახდინონ მისი ორივე ჯაჭვის ჰიბრიდიაცია მონიშნულ ზონდთან. ყველაზე გავრცელებული მეთოდი ქრომოსომებთან in situ ჰიბრიდიზაციისათვის გამიზნული ზონდების მოსანიშნად, არის მათი შეღებვა ფლუორესცენტული (მნათი) საღებავებით. როცა ქრომოსომას აკვირდებიან სინათლის ისეთი სიგრძის ტალღაზე, რომელიც იწვევს საღებავის ფლუორესცენციას, ჰიბრიდიზებული ზოლი ნათებას იწყებს. მიკროსკოპში კარგად ჩანს ჰიბრიდიზაციის ნიშანი, ესე იგი ჩანს ამ ზონდთან ჰიბრიდიზებული დნმ-ის სეგმენტიც. ეს მეთოდი, რომელსაც Fluorescence in situ hibridization (FISH) მეთოდსაც უწოდებენ, ფართოდ გამოიყენება როგორც სადიაგნოსტიკოდ _ ციტოგენეტიკაში, ისე გენური რუკების შესადგენად.

ბოლო პერიოდში ადამიანის ქრომოსომების უფრო სრულყოფილი ანალიზისათვის შეიმუშავეს FISH მეთოდის ორი მოდიფიცირებული ვარიანტი. პირველი, შედარებითი გენომური ჰიბრიდიზაცია, გამოიყენება გარკვეული ქრომოსომული სეგმენტის დნმ-ის ორ სხვადასხვა ნიმუშს შორის ასლების რაოდენობის და დოზის მიხედვით სხვაობის შესაფასებლად; ხოლო მეორე მეთოდი, ეს არის სპექტრული კარიოტიპირება (SKY), რომელიც იყენებს 24 ზონდს, რომლებიც სხვადასხვა ფერად ღებავენ ადამიანის ქრომოსომებს_ყოველ ქრომოსომას შეესაბამება თავისი სპეციფიკური ზონდი. საბოლოოდ FISH მეთოდით ხდება მეტაფაზური ქრომოსომების ჰიბრიდიზაცია ადამიანის ქრომოსომების 24-ივე ზონდთან. ვინაიდან თითოეული ქრომოსომის მიმართ სპეციფიკური ზონდს აქვს მისთვის დამახასიათებელი ნათება, ქრომოსომების სტრუქტურული ცვლილებები ვლინდება ვიზუალურად და ამ დარღვევის მტარებელი ქრომოსომაც ადვილად განირჩევა სხვა ქრომოსომებისაგან.

დნმ-ის თანამიმდევრობების ანალიზი (დნმ სექვენირება)

დნმ-ის თანამიმდევრობების ანალიზისათვის ყველაზე ხშირად მიმართავენ სენგერის სექვენირების მეთოდს (მეთოდი ატარებს ფრედ სენგერის სახელს, რომელმაც დნმ-ის სექვენირების გაუმჯობესებისათვის 1980 წელს მიიღო ნობელის პრემია ვალტერ გილბერტთან ერთად). დღესდღეობით შესაძლებელია დნმ-ის ნებისმიერი გასუფთავებული სეგმენტის თანამიმდევრობის განსაზღვრა, იქნება ეს კლონირებული ფრაგმენტი, თუ PCR-ის საშუალებით ამპლიფიცირებული თანამიმდევრობა. ამ მეთოდით მატრიცის კომპლემენტარული ჯაჭვის აგებისას, დნმ პოლიმერაზას ინჰიბირებისათვის ნუკლეოტიდების ქიმიურ ანალოგებს იყენებენ.

ამჟამად, დნმ-ის სექვენირების პროცესი ავტომატიზებულია. ეს მეთოდი ხშირად გამოიყენება ნორმალური ან მუტანტური გენების საანალიზოდ. ავტომატიზებულ სექვენირების მეთოდს იყენებდნენ ადამიანის გენომის პროექტზე მუშაობის დროსაც, რის საფუძველზეც მოხდა მთლიანი გენომის 3 მილიარდამდე ნუკლეოტიდის თანამიმდევრობის განსაზღვრა. ადამიანის გენომის ანალიზით, რომელიც მეცნიერებმა აუწყეს მსოფლიოს 2001 წლის თებერვალში, ასევე დადგენილია, რომ გენომი შედგება დაახლოებით 26 000-დან 40 000-მდე გენისაგან. თუმცა, უკვე ცნობილია (კომპიუტერული პროგრამების გადამოწმებით), რომ ადამიანის გენომი წარმოდგენილია 90 000-დან 100 000-მდე გენით. გენომის ანალიზის მონაცემთა, სხვადასხვა წყაროზე დაყრდნობით დასტურდება, რომ ნებისმიერ ორი პიროვნების გენეტიკური თანამიმდევრობის 99,9% იდენტურია, რაც იმას ნიშნავს, რომ ყველა ის საოცარი განსხვავება, რაც არსებობს ადამიანებს შორის, რომელთა არსებობაც გენებს უნდა მივაწეროთ, დაფუძნებულია გენეტიკურ თანამიმდევრობათა 0,1%-ზე. ასე, რომ ადამიანის გენეტიკის რეალური ამოცანა ჯერ კიდევ წინ არის, რომლის მიზანია გაარკვიოს თუ როგორ ახერხებენ გენები ჩვენი ორგანიზმის კონსტრუქციის და სასწაულებრივი მექანიზმების შენარჩუნებას და როგორ შეიძლება მიღებული მონაცემები გამოყენებულ იქნას ჯანმრთელობის გასაუმჯობესებლად.

მიკროარეი – მინის პლასტმასის, ან სილიკონისგან დამზადებული თხელი დისკი, რომელსაც ხშირად ”ჩიპს” უწოდებენ. არეიზე აწვეთებენენ მრავალ სხვადასხვა ნუკლეინის მჟავას, სხვადასხვა ზონდებთან ჰიბრიდიზაციისთვის.

ნოზერნ-ბლოტი – ფილტრი, რომელზეც გადააქვთ რნმ, რადგან რნმ–ის მოლეკულები დააცილონ ერთმანეთს – ზომაში მათი განსხვავების საფუძველზე.

საუზერნ-ბლოტი – ფილტრი, რომელზეც გადააქვთ დნმ – მოლეკულების ზომის მიხედვით დაცალკევების მიზნით.

ვესტერნ-ბლოტი – ფილტრი, რომელზეც გადააქვთ ცილის მოლეკულები – ზომის მიხედვით დაცალკევების მიზნით.